Soorten fluorescentiemicroscopen

Toen de microscopen rond 1600 G.T. werden uitgevonden, richtten natuurfilosofen hun blik op een wereld binnen een wereld. Toen Antony van Leeuwenhoek kleine, sterk gebogen lenzen en een mechanische houder maakte om het zicht aan te passen, opende hij een venster op de microscopische wereld van bacteriën, bloedcellen, protozoa en de celstructuur van planten. Maar in de geschiedenis van de microscopie is er altijd één vraag geweest: wat zijn deze vreemde dingen die door een lens worden gezien? Fluorescentiemicroscopie verwijst naar een reeks technieken die die onzekerheid minimaliseert - omdat in fluorescentiemicroscopie wanneer licht op een monster schijnt, het zijn eigen licht meteen terug laat schijnen.

epifluorescentie

Veruit de meest voorkomende fluorescentiemicroscoop is de epifluorescentieconfiguratie. In een epifluorescentiemicroscoop schijnt een lichtbron - meestal een kwik- of xenonlamp - door een filter dat een smal golflengtegebied selecteert. Het gefilterde licht schijnt op het monster door de objectieflens van de microscoop. Het binnenkomende licht wordt geabsorbeerd door fluoroforen - moleculaire labels die licht met een lange golflengte uitstralen wanneer ze licht met een kortere golflengte absorberen. Licht van de fluoroforen, samen met verstrooid licht van de verlichtingsbron, gaat terug in de objectieflens en naar de detector of het oog. Onderweg blokkeert een ander filter het verlichtingslicht, dus alles wat overblijft is het fluorescerende licht van het monster.

confocaal

Een epifluorescentiemicroscoop verzamelt licht van overal binnen het gezichtsveld van de microscoop. Een deel van het excitatielicht wordt vóór het brandpuntsvlak van de microscoop geabsorbeerd, een deel in het brandvlak en een deel buiten het brandvlak. Omdat de microscoop al dat licht opvangt, zal het beeld een scherp beeld van licht in de focus bevatten, maar zal het ook onscherp licht uit andere regio's hebben. Een confocale microscoop corrigeert dat door een laservlek in hetzelfde vlak als de microscoop te focussen. Dan gaat er een gaatje voor de detector, waar het al het licht blokkeert dat niet van de microscoopfocus komt. Door het monster te scannen, kan een schoon driedimensionaal beeld van het object worden verkregen.

Multifoton

In een confocale microscoop is de uitlijning erg gevoelig. Als de laservlek, het objectief van de microscoop, de optica voor het verzamelen en het gaatje er zelfs maar de geringste hoeveelheid uit zijn, lijden de prestaties van de microscoop eronder. Een multifotonenmicroscoop lost dit probleem op door een lasergolflengte te gebruiken die maar half zo energiek is als nodig is om de fluoroforen in het monster te exciteren. De enige manier waarop de fluoroforen opgewonden raken en fluorescentie uitzenden, is als het laserlicht helder genoeg is zodat twee lichtdeeltjes - fotonen - de fluorofoor in zeer korte tijd treffen. Dat gebeurt alleen als de laser op een heel klein plekje wordt scherpgesteld. Dus de enige plek in het monster die licht uitstraalt, is waar de laser is gefocust, waardoor het beeld mooi en schoon blijft omdat er geen extra achtergrondlicht is om te verwijderen -- wat betekent dat er geen gaatje is om uit te lijnen.

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF)

Een andere manier om zeer zuivere beelden te krijgen, is ervoor te zorgen dat het excitatielicht niet erg ver in het monster komt. Als bijvoorbeeld een klodder neuronen in een druppel oplossing op een glasplaatje wordt geplaatst, zullen sommige neuronen zich aan het glasoppervlak hechten. In een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop wordt het licht zijwaarts in het glasplaatje gericht, zodat het niet echt in de oplossing komt die de cellen vasthoudt. Maar een deel van het licht lekt nauwelijks in de oplossing - gewoon heel dicht bij het oppervlak van het glas. Dit betekent dat de enige plaatsen die licht zullen uitstralen zich in een zeer dun gebied direct tegen het glasoppervlak bevinden. Voor zoiets als neuronen, waar zoveel interessante dingen gebeuren op het oppervlak van de cellen, kan deze techniek erg effectief zijn.

Super-resolutie

Alle microscopen - inclusief fluorescentiemicroscopen - worden beperkt door de fysica die de voortplanting van licht regelt. Een van de basisregels is dat een geconcentreerde lichtvlek maar zo klein kan worden - en niet kleiner. Voor zichtbaar licht is die grootte ongeveer 200 nanometer, of 200 miljardste van een meter. Maar afzonderlijke moleculen zijn maar een paar nanometer groot, dus er zijn veel interessante kenmerken die onder die limiet liggen, de diffractielimiet genoemd. Wetenschappers ontwikkelen 'superresolutie'-technieken om die limiet te omzeilen. Gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie zijn bijvoorbeeld beide fluorescentiemicroscopiemethoden die de grootte van de lichtemitterende plek beperken door de grootte van de excitatielichtvlek te verkleinen.